苯甲酸鈉又稱安息香酸鈉,是廣泛應用于食品及碳酸飲料產(chǎn)業(yè)中的防腐劑。多年來世界上大多數(shù)國家一直允許用SB作為食品防腐劑,最大允許量在0.15~0.25wt%之間,在美國,SB的最大允許量為0.1wt%。隨著食品工業(yè)的發(fā)展,食品中使用防腐劑的現(xiàn)象十分普遍。過去曾認為SB對人體無毒,但最近的研究表明,其可造成人體組織器官或機能的損害,具有遺傳毒性,使染色體分裂出現(xiàn)異常,使染色體發(fā)生結構畸變以致斷裂并且會產(chǎn)生肝硬化、肌肉損傷甚至致癌,Tsay等發(fā)現(xiàn)SB能使斑馬幼蟲發(fā)生畸變。長期飲用含有SB的碳酸飲料易使兒童產(chǎn)生多動癥。因此,苯甲酸鈉的生物安全性和對人體的危害程度必然要引起我們的重視。

將Balb/c系小鼠斷髓處死,在超凈臺內(nèi)無菌分離雙側腋窩、鎖骨下、腹股溝淺表淋巴結和腸系膜淋巴結,PBS清洗,去除被膜,機械研磨,于200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾。收集細胞,用4oCPBS1200r/min離心5min。洗滌細胞2次,重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%FBS及50μmol/Lβ-巰基乙醇),調(diào)整細胞密度為1×106/mL。臺盼藍染色觀察細胞活力,活細胞數(shù)占98%。添加SB溶液至淋巴細胞培養(yǎng)液中,終濃度分別為0wt%、0.05wt%、0.1wt%和0.2wt%。將細胞在24孔板接種后放置于37oC、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h、6h、12h、18h。

樣品制備分別取與不同濃度SB作用1h、6h、12h、18h后的淋巴細胞,滴于新剝離的云母片上,使其自然鋪展,吸附10min,然后用2.5%的戊二醛(日本京都產(chǎn))固定15min,用蒸餾水沖洗3次,室溫自然干燥。

AFM成像將制備好的樣品置于AFM(AutoprobeCPResearch,Thermomicroscopes公司,USA)的XY掃描臺上,用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域,在空氣中室溫下利用接觸或非接觸模式成像。AFM圖像僅經(jīng)過自帶軟件(IP2.1版)的平滑處理,以消除掃描方向上的低頻背景噪音。

實驗結果經(jīng)AFM掃描成像,獲得了正常淋巴細胞、與不同濃度SB作用不同時間后的淋巴細胞的拓撲形貌圖(Topography)和誤差信號圖(Errorsignal),并分別對其表面超微結構進行了掃描分析,觀察細胞數(shù)超過30個。檢測結果發(fā)現(xiàn),上述3種淋巴細胞均呈不同程度的形態(tài)結構改變。正常淋巴細胞呈較為規(guī)則的圓形,中間隆起,細胞表面總體較為平滑,高度在1.8~2.5μm之間,直徑約為8~10μm。而與不同濃度SB作用后的淋巴細胞體積明顯發(fā)生變化。高度減少,細胞表面形態(tài)結構更為復雜,中間部位出現(xiàn)明顯破裂并且凹陷,呈“Y”型結構,邊緣能觀察到有細微損傷分布,并且隨著SB濃度的增加,細胞形態(tài)進一步發(fā)生改變,呈中間凹陷狀,細胞邊緣向四周扁平鋪展。細胞表面球狀顆粒進一步增多,表面粗糙度增大,細胞高度明顯減少,直徑增加(高度由2μm逐漸減少至1μm,直徑由6μm逐漸增加至12μm)。對其局部小范圍進行觀察,AFM能清楚地觀察到細胞膜密集的顆粒狀突起物以及大量的孔洞,其中凹凸不平的細胞表面分布著大量小顆粒。選取不同細胞膜超微結構圖的整個區(qū)域(5μm×5μm)進行測量,與SB作用后淋巴細胞的四個參數(shù)值均明顯與正常淋巴細胞不同;對淋巴細胞膜形成的大小不一的顆粒進行統(tǒng)計,經(jīng)SB作用后的淋巴細胞膜形成的顆粒逐漸增大。同時,隨著與SB作用時間的延長,淋巴細胞出現(xiàn)的變化與上述情況類似,即作用時間越長,細胞損傷越嚴重,淋巴細胞的表面粗糙度也逐漸增加。

AFM是樣品表面信息的收集工具,較易獲得細胞的形貌、超微結構及其生化反應后細胞形態(tài)變化等信息,是研究細胞損傷的有力工具。淋巴細胞是機體免疫應答功能的重要細胞成分,其形態(tài)結構與其功能息息相關。因此利用AFM研究淋巴細胞與外界環(huán)境相互作用前后細胞形態(tài)結構及其細胞膜的變化,對了解淋巴細胞的生理功能具有十分重要的意義。

蘇州飛時曼精密儀器有限公司成立于2013年，坐落在美麗的蘇州高新區(qū)科技城，是一家起點高、前瞻性強的研發(fā)和制造型高科技企業(yè)。公司的核心研究方向為光、機、電、算一體化的微納米檢測設備、先進的醫(yī)療儀器。飛時曼作為國內(nèi)自主品牌、原子力顯微鏡廠家，其主要產(chǎn)品有：原子力顯微鏡系列（多模式原子力顯微鏡 FM-Nanoview1000AFM、一體式原子力顯微鏡 FM-Nanoview6800AFM、拉曼原子力顯微鏡一體機 FM-NanoviewRa-AFM、光學原子力顯微鏡一體機 FM-NanoviewOp-AFM、教學型原子力顯微鏡 FM-Nanoview T-AFM、教學型掃描隧道顯微鏡 FM-NanoviewT-STM、工業(yè)型原子力顯微鏡 FM-NanoviewLS-AFM、拉曼光譜儀RM5000、拉曼光譜儀RM8000、拉曼光譜儀RM9000）。2015年，公司獲得江蘇省高新技術企業(yè)認證，擁有自主知識產(chǎn)權30多項，研發(fā)的多款產(chǎn)品被評為高新技術產(chǎn)品，并通過CE、ISO9001、SGS認證。